无细胞蛋白合成和纯化B淋巴细胞抗原CD19新应用：使用eProtein Discovery无细胞蛋白表达系统快速达成

哈佛官网资讯点击下图查看哈佛官网资讯⬇️英国Nuclera公司的eProtein Discovery是一个无细胞蛋白质合成CFPS系统也被称作体外转录/翻译系统能够实现蛋白质的快速原型设计。该系统采用数字微流控芯片和定制试剂可针对多达192种条件筛选蛋白质表达与可溶性包括在8种无细胞蛋白合成条件下对至多24种构建体的筛选。可在48小时内完成从DNA到蛋白质筛选与放大生产。一、引言B 淋巴细胞抗原CD19是一种跨膜糖蛋白为B细胞恶性肿瘤生物标志物、CAR - T等疗法理想靶点包含单个跨膜螺旋292-313、天然信号肽1-20、胞外N端结构域ECD和胞内C端结构域ICD。其ECD有两个通过二硫键连接的免疫球蛋白样C2型结构域ICD有多个无序区域。生产CD19尤其是ECD对开发新的B细胞淋巴瘤治疗方法十分重要。然而ECD素来有“难表达”的特点会导致表达滴度低、蛋白质错误折叠和聚集阻碍了对细胞表面分子的详细分子研究。在本应用中我们利用eProtein Discovery系统的可溶性标签选择功能和无细胞混合物在24小时内筛选了192种表达条件优化了可溶性CD19蛋白的生产如图1所示。我们成功表达并纯化了全长CD19、ECD和ICD。筛选完成后在24小时内将适合条件进行放大可生产微克级的蛋白质从而实现了治疗研究所需复杂蛋白质的提效生产。本应用为表达其他具有跨膜结构域、二硫键和高度无序区域的“难表达”蛋白质提供了参考。二、eProtein Discovery工作流程eProtein Discovery系统利用无细胞蛋白质合成技术可快速筛选蛋白质构建体并放大生产复杂蛋白质图1。图1. eProtein Discovery工作流程。从DNA到可溶性蛋白只需48小时。在本研究中选择了三种CD19长度变体全长CD19CD19_21-556、N端截短体CD19_21-277和C端截短体CD19_327-556。这两种截短体均去除了CD19的跨膜区域。此外全长和N端截短体均省略了初始信号肽序列0-20。这些变体被输入eProtein Discovery软件并进行密码子优化随后添加3C和TEV侧翼序列。使用可溶性筛选构建体试剂盒生成包含不同可溶性标签的表达构建体以及一个不含可溶性标签的构建体。每个构建体的C端均整合了用于磁珠纯化的Strep标签和用于表达纯化后蛋白质定量的检测标签图2A。图2. 实验筛选条件。A为三种CD19长度变体生成的带有可溶性标签的 eGene 构建体。在制备eGene构建体后向8种包含无细胞核心试剂的无细胞混合物中添加各种添加剂包括分子伴侣DnaK、二硫键促进剂PDI/GSSG和可溶性标签切割酶3C蛋白酶图2B。图2. 实验筛选条件。B用于提高可溶性蛋白产量的无细胞混合物选择。将24种eGene构建体和8种无细胞混合物与纯化磁珠、对照/空白样品和缓冲液一起加样到卡盒上。这种利用eProtein Discovery系统的设置促进了192种表达谱的自动生成和分析。每种CD19变体表达最高的10种eGene/无细胞混合物组合会被自动选择用于纯化并完成蛋白质检测以确定预测的放大产量所有这些都在24小时内完成。对于每种CD19变体将预测产量至高的表达方案第二天进行放大生产并使用放大试剂盒进行纯化以生产微克级的蛋白质。蛋白质纯度和产量通过SDS-PAGE和荧光测定法进行定量分析。三、结果eProtein Discovery系统成功表达并纯化了全长CD19蛋白及其截短变体证明了其强大的性能见图 3。该系统用于快速筛选192种表达条件并在24小时内获得30个可纯化性数据点以确定生产可溶性CD19蛋白变体的最佳条件图 3A 和 3B。图3. 筛选结果。A表达产量图3. 筛选结果。B纯化浓度在三种CD19变体中N端胞外结构域CD19_21-277的蛋白产量更高预测产量达29.68 μg/200 μL图 3C。图3. 筛选结果。C预测产量引入可溶性标签尤其FH8标签使CD19总产量显著提升32%无细胞混合物中添加PDI/GSSG可促进二硫键形成提升ECD表达量混合物4与FH8标签联用预测产量更高混合物3则兼具高产量与标签切除灵活性。该系统成功筛选出生产可溶性全长CD19的条件产量4.29 μg/200 μL混合物3表现优体现优化蛋白生产的多功能性与精准性不过全长CD19产量仍需优化。无细胞系统有效降低了天然系统中无序蛋白常见的蛋白酶降解风险同时通过可溶性标签和添加剂的使用减少不溶性聚集物的产生。这一能力使得该挑战性蛋白得以成功表达和纯化。在筛选192种表达条件并纯化30种以确定预测产量后每种CD19变体的合适条件被放大在24小时内生产出微克级蛋白用于下游应用。SDS-PAGE分析证实所有CD19变体均成功表达其中N端ECD纯度达88%C端胞内结构域纯度达100%但全长蛋白纯度较低。通过内部荧光测定和SDS-PAGE进行的蛋白产量定量与预测产量高度吻合证明了该系统从筛选到放大的可靠性。总体结果证实了eProtein Discovery系统在明显加速高质量复杂蛋白生产方面的有效性和精确性。四、结论通过同步测试不同CD19蛋白构建序列、可溶性标签及蛋白表达参数eProtein Discovery可在24小时内快速确定合适的蛋白表达条件并在48小时内获得目标蛋白。这一能力使研究人员能够快速开展蛋白靶点鉴定及疾病机制相关蛋白的验证工作。该系统整合数字微流控技术、蛋白质质量分析及无细胞蛋白合成技术即使对于最难表达的蛋白质也能实现快速制备从而大幅简化了研究流程。延伸阅读https://www.mine-bio.com/nuclera/?utm_sourcecsdnutm_mediumreferralutm_campaignnuclera_article本文基于nuclera公开资料由其中国提供商上海曼博生物整理仅用于科研信息分享。上海曼博生物可提供无细胞蛋白合成系统、eProtein Discovery系统及高通量蛋白筛选相关产品与技术支持。